免費(fèi)發(fā)布：急性肝胰腺壞死病檢測(cè)方法

cuiluosheng

附件內(nèi)的《急性肝胰腺壞死病檢測(cè)方法公告》為泰國(guó)Mahidol大學(xué)Tim Flegel教授與臺(tái)灣成功大學(xué)羅竹芳教授最新發(fā)布的檢測(cè)方法公告，在閱讀他們公告的過(guò)程中深為二位專家以及他們團(tuán)隊(duì)的行業(yè)責(zé)任感所折服，為此，學(xué)習(xí)完報(bào)告之后，遂盡自己的微薄之力將之翻譯好，供行業(yè)相關(guān)人員參考、交流、學(xué)習(xí)！


AHPND細(xì)菌PCR檢測(cè)方法公告.pdf (654.78 KB, 下載次數(shù): 32)

2013-12-30 12:54 上傳

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胡路怡

好文章好文章，崔兄辛苦了哈

一醉千年

崔兄速度夠快！我上午看著新聞了，英文不夠好，勉勉強(qiáng)強(qiáng)翻譯了兩段。你這全文翻譯了，辛苦辛苦！

my_chb

{:soso_e179:}

daoming4

非常感謝能夠?qū)⑶把匦畔⒓皶r(shí)傳遞給大家，只是感覺(jué)翻譯的有點(diǎn)生硬。

raymin

支持支持支持支持支持

zjxenter

謝謝分享呀  以后用到再下載 呵呵

cuiluosheng

daoming4 發(fā)表于 2013-12-26 14:01
非常感謝能夠?qū)⑶把匦畔⒓皶r(shí)傳遞給大家，只是感覺(jué)翻譯的有點(diǎn)生硬。

水平有限，有些英語(yǔ)長(zhǎng)句讀著讀著就暈了！

kanhai

小崔開(kāi)始走國(guó)際路線了

cuiluosheng

此文為臺(tái)灣成功大學(xué)發(fā)布的新聞稿，其中關(guān)于檢測(cè)結(jié)果的部分翻譯更加準(zhǔn)確，請(qǐng)各位大俠參考這份為準(zhǔn)！
自2009年開(kāi)始，亞洲蝦類養(yǎng)殖開(kāi)始爆發(fā)一種未知的新興疾病，漁民發(fā)現(xiàn)在放苗后的30天內(nèi)，蝦苗會(huì)出現(xiàn)大量死亡，因此得名為偷死癥或早死癥 (early mortality syndrome, EMS)。病蝦的肝胰腺會(huì)變白及萎縮，且此器官變得難以用手指搓碎；在組織切片檢驗(yàn)下，肝胰腺細(xì)胞呈現(xiàn)壞死及脫落至肝胰腺小管外，亦有大量的血細(xì)胞侵入肝胰腺，造成嚴(yán)重的發(fā)炎反應(yīng)。也因?yàn)楸炯膊��?huì)造成蝦類肝胰腺功能嚴(yán)重受損，因此EMS的正式疾病名則稱之為急性肝胰腺壞死綜合癥 (Acute Hepatopancreas Necrosis Disease，AHPND)。直至今日，此疾病已在中國(guó)大陸、越南、馬來(lái)西亞和泰國(guó)等重要蝦類養(yǎng)殖大國(guó)爆發(fā)，平均一年因AHPNS所造成的損失超過(guò)十億美元。
        由于AHPND已漸擴(kuò)展并威脅著全球蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，科學(xué)家、養(yǎng)殖企業(yè)及第一線養(yǎng)殖業(yè)者共同齊心尋找其致病原因。在2013年5月時(shí)，位于University of Arizona，隸屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織參考實(shí)驗(yàn)室(OIE reference lab)主持人Prof. Donald V. Lightner首度鑒定出Vibrio parahaemolyticus (VP)乃AHPND的致病原，此研究對(duì)于養(yǎng)蝦產(chǎn)業(yè)解決AHPND威脅跨出了重要的第一步。然而，對(duì)于蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)而言，他們亟需檢測(cè)平臺(tái)以協(xié)助檢測(cè)種蝦、蝦苗、生物餌料…等等是否帶有此VP變異株，藉以阻斷病原體在蝦場(chǎng)中的侵入與散布，得以降低AHPND爆發(fā)的可能性。由于致病性VP檢測(cè)平臺(tái)于蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)生物安全管理上的必須性及絕對(duì)重要性，大家對(duì)此都引頸期盼并迫切需要，一旦有高專一性、高靈敏性的檢測(cè)平臺(tái)建立，將是解決全球AHPND爆發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)。
        本校生物科學(xué)與科技學(xué)院院長(zhǎng)羅竹芳院長(zhǎng)帶領(lǐng)其研究團(tuán)隊(duì)，與泰國(guó)Mahidol University的Professor T.W. Flegel進(jìn)行跨國(guó)合作，于今年(2013年)12月，領(lǐng)先全球公布了「先導(dǎo)型AHPND關(guān)鍵檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)」，可以短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出致病性VP的存在，并以公開(kāi)信息的方式，免費(fèi)提供給全球養(yǎng)蝦產(chǎn)業(yè)使用。在此公開(kāi)、免費(fèi)使用的操作模式下，省去準(zhǔn)備專利申請(qǐng)文件、證照、商用檢測(cè)試劑盒上市諸如此類冗長(zhǎng)的等待時(shí)間，藉由檢測(cè)方式幫助相關(guān)業(yè)者制定有效方針因應(yīng)AHPND爆發(fā)，立即性的阻絕AHPND的傳播路徑，并降低全球養(yǎng)蝦產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。此外，這個(gè)關(guān)鍵檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的建立，除了是成功的跨國(guó)合作案外，藉由國(guó)立成功大學(xué)、統(tǒng)一企業(yè)總公司、臺(tái)灣行政院國(guó)家科學(xué)委員會(huì)以及國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)的緊密互動(dòng)下，成為產(chǎn)學(xué)合作、解決產(chǎn)業(yè)困境的典范案例。
        利用了次世代定序及系統(tǒng)生物學(xué)方式，羅院長(zhǎng)及其團(tuán)隊(duì)利用全基因體解序策略，發(fā)現(xiàn)具有致病性的VP帶有特殊、獨(dú)立于染色體DNA之外的大型質(zhì)體DNA，目前也推測(cè)致病的細(xì)菌毒素基因也應(yīng)位于此質(zhì)體DNA上。因此羅院長(zhǎng)利用質(zhì)體的特殊序列做為偵測(cè)目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)出AP1及AP2等兩對(duì)引子對(duì)，以PCR技術(shù)做為檢測(cè)方式，希望能在更深入的研發(fā)過(guò)程之前，先以此發(fā)展為「先導(dǎo)型AHPND關(guān)鍵檢測(cè)PCR技術(shù)平臺(tái)」。若生物體存在有致病性VP，理論上可同時(shí)被AP1及AP2偵測(cè)到陽(yáng)性反應(yīng)。雖然此檢測(cè)平臺(tái)的效用還需要大規(guī)模的樣本測(cè)試，但由于情況緊急，羅院長(zhǎng)及泰國(guó)團(tuán)隊(duì)決定先行公開(kāi)這項(xiàng)初步但重要的信息，得以減緩養(yǎng)蝦產(chǎn)業(yè)因AHPND所造成急遽攀升的經(jīng)濟(jì)損失。
        由于此為「先導(dǎo)型檢測(cè)PCR技術(shù)平臺(tái)」，基于研究責(zé)任道義，羅院長(zhǎng)團(tuán)隊(duì)及泰國(guó)團(tuán)隊(duì)對(duì)此提出數(shù)項(xiàng)聲明與前驅(qū)檢測(cè)成果闡釋，使此技術(shù)平臺(tái)更加透明化:
1. 在更大規(guī)模的生物樣材測(cè)試前，我們不能保證此PCR檢測(cè)方式不會(huì)對(duì)所有非AHPND致病菌及相關(guān)生物有反應(yīng)。我們也不能保證此方法能夠偵測(cè)出所有造成AHPND的細(xì)菌。但我們誠(chéng)摯邀請(qǐng)所有相關(guān)業(yè)者協(xié)助驗(yàn)證這項(xiàng)新的檢測(cè)方法。
2. 在測(cè)試的68個(gè)生物樣本中，有67個(gè)樣本利用此兩對(duì)引子對(duì)(AP1及AP2)得到相同的陽(yáng)性或陰性結(jié)果。然而有1個(gè)樣本利用AP1得到陽(yáng)性結(jié)果，用AP2則得到陰性結(jié)果。
3. 在聯(lián)合國(guó)世界糧農(nóng)組織(FAO) 于越南地區(qū)的研究中，收集的14個(gè)樣本中，有5個(gè)組織病理切片判斷為陰性結(jié)果的樣本，利用此法檢測(cè)也同為陰性結(jié)果。然而，在8個(gè)組織病理切片被判斷為AHPND陽(yáng)性的生物樣本，利用此PCR檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)后，有5個(gè)同樣為陽(yáng)性結(jié)果，但有3個(gè)為陰性結(jié)果。
4. 在68個(gè)被推論可造成AHPND的測(cè)試細(xì)菌樣本中，利用此PCR方法檢測(cè)都呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。而于2002年的池塘采集樣本中，有3株細(xì)菌已被確認(rèn)它們不會(huì)造成AHPND也不會(huì)造成蝦只死亡，利用此PCR方法檢測(cè)后得到陰性結(jié)果。
5. 測(cè)試過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有一菌株，蝦體致病后的組織病理切片顯示，雖非AHPND，但實(shí)際卻造成蝦只嚴(yán)重死亡及不正常肝胰腺病理切片，利用此PCR方法亦是得到陽(yáng)性結(jié)果。
6. 利用此方法檢測(cè)Shewanella, Rhodococcus, Leifsonia, Delftia, Ralstonia, V. vulnificus, V. harveyi, V. alginolyticus以及 B. subtilis都得到陰性結(jié)果。

        羅院長(zhǎng)表示，希望「先導(dǎo)型AHPND關(guān)鍵檢測(cè)PCR技術(shù)平臺(tái)」能夠加快對(duì)于AHPND傳染機(jī)制的了解進(jìn)而達(dá)到最終的疾病控制。此外，羅院長(zhǎng)團(tuán)隊(duì)也非常歡迎任何單位使用此方法后所能提供心得及任何寶貴建議。


「先導(dǎo)型AHPND關(guān)鍵檢測(cè)PCR技術(shù)平臺(tái)」于AHPND致病菌檢測(cè)操作步驟

除了下述的實(shí)驗(yàn)流程之外，用戶也可利用下述序列進(jìn)行較短的PCR產(chǎn)物反應(yīng)或巢式PCR法的檢測(cè)設(shè)計(jì)。然而這些經(jīng)改良的方法會(huì)產(chǎn)生許多偽陽(yáng)性的結(jié)果，因此這些改良的方法比較不建議使用。利用AP1及AP2兩對(duì)引子對(duì)，各自能產(chǎn)生約700 bp的PCR產(chǎn)物。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程如下。
1. 利用一般DNA萃取方法，萃取感染蝦只的胃、肝胰腺或分離的菌株DNA。
2. 于25 μl PCR反應(yīng)體積中，加入10-100 ng范圍之間的上述DNA萃取物。
3. 兩對(duì)引子對(duì)(AHPND primer set 1 [AP1]及AHPND primer set 2 [AP2])主要使用在放大AHPND bacterial DNA片段。以下為正股及反股的引子序列:
AP1F: 5’- CCT TGG GTG TGC TTA GAG GAT G -3’
AP1R: 5’- GCA AAC TAT CGC GCA GAA CAC C -3
AP2F: 5’- TCA CCC GAA TGC TCG CTT GTG G -3’
AP2R: 5’- CGT CGC TAC TGT CTA GCT GAA G -3’
4. PCR反應(yīng)的條件為: [94°C 5分]-[(94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 60秒) 此三步驟重復(fù)25~30次]-[最終的72°C 10分]。隨后PCR產(chǎn)物將進(jìn)行瓊脂膠體電泳之后，經(jīng)由溴化乙錠染色然后照射紫外線后可看到PCR產(chǎn)物。AHPND陽(yáng)性的樣本，可看到約700 bp的產(chǎn)物，然而AHPND陰性的樣本則看不到PCR產(chǎn)物。如果需要陽(yáng)性對(duì)照組的話，可以連絡(luò)羅院長(zhǎng)研究團(tuán)隊(duì)，其可寄送含有目標(biāo)片段的質(zhì)體DNA，可以經(jīng)由大腸桿菌系統(tǒng)放大及保存，可供永久使用。


PCR Protocol
Pre-heat: 94°C, 5min
PCR 25~30 cycles with:
Denaturation: 94°C, 30 sec
Annealing: 60°C, 30 sec
Extension: 72°C, 60 sec
Final extension: 72°C, 10 min
Amplicon: ~700 bp

PCR Primers and Target Sequences
AHPND Primer Set 1 (AP1)
AHPND Primer set 1 Forward (AP1F) –
5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’
AHPND Primer set 1 Reverse (AP1R) –
5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’
AP1 Amplicon- 700 bp
AP1 Target Sequence
CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATGATGAAGATGACTATGTCCTCGAACGATTTGAGTTGCGAGT
TCACGGTCGTAAACCACTCGTTCTCAATCGCCCCTCGTTTTCCAAACTCATGTTCGTCACCC
AGCAGTATCTCCACACGTCACAGGAAACCACCAAGCGAATATTAAGAGCCACCATCTTAGAA
AGTGCTGAGCCCTTCACGGCGGATGAACACTGCCGATTGGTCTCTGCACTCGAAAGGCACTT
AGCTGACGTCCATGAATGAAAAAACCCGATAACATCATCATGTTATCGGGCTATTTGGTGTC
ATCAGTGTGTTTGTGTTTGGCGGTTTTACAACCATTCTTCAGCACATTCATGTGTTATCGCA
TCAGTGGTTTCAGTGATCGTGGCAGACTGAAACCCGCCGACGATGGGATTTAACGCTAAATT
CGCTACTCTCTTCGCCTCATCAAAGCAAGGAAGCACTGCAACGTACTCCTTACCCCAACTCA
CTTCAAGCGTAACTCGGCAAGCACCTTTATACCCAACCGAAACATGAACTTCTGCATCAAGC
CGGTGTTCATCGCCGTTCAATAATGAATTCATCAGCGCGCCCTCGTTAAAGAGCATTAGAAG
TGATGCACTGGAATGTTAAACCAACACACCAATGCATCGTAGAACGCCGAAATAACAGGGTG
TTCTGCGCGATAGTTTGC

AHPND Primer set 2 (AP2)
AHPND Primer set 2 Forward (AP2F) –
5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’
AHPND Primer set 2 Reverse (AP2R) –
5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’
AP2 Amplicon- 700 bp
AP2 Target Sequence
TCACCCGAATGCTCGCTTGTGGCTCAGCGAGCATGGGGTCACGCCTCTATAAGTGCAAAAAC
TCTGGCTGTACCTACTACACCAAATACCTCAATCAAAGCTGTAAGTCTCGAGCTTGCTGCAG
TGGTGGCGTCAAATCCACCGAAAGGTGGATGGTTGCTTAATCGATTATTCAAATGCGCGTCC
AACATTTTAACGACTTGGGCGAAACGGCAAGACTTAGTGTACCCAGAGCCAAAACCTCATCG
AAAATCAGGATTGTTGCTTCCTACGTTGAAAGACCGGCGTTATCAGCTTCATATCCCCCACC
TCTGTCACGCCTGCGTGGATCGCTGAATGACTGTAAAAAATGACAATAAAGATTGATCAATC
TCAGAAACGTTTTGGGACAAAAATGGTTCAACAATATCTGCTGGGTATGTGGCTATCCAAAC
AATATTCTTGATAAAGGCTGGGAAATGGAAAATTCACTCTCCAAATACACCAAATTAGTACA
GAAATTTATACAATTACAGTAACATGAATCCGTCATACTGGCAGCAAGGAGTTCATGTGAGC
CAACAAGAAGAAAAATACCCGGCCAGCGCCATATCCTCCTGGAGCGGCTTTGTTTACCAAGG
AAAAGTCGCACTATATCACTCACTTAAGCTTATTCTCGATGATGATTTGGACTTCGAACTTC
AGCTAGACAGTAGCGACG

如需詳細(xì)信息，請(qǐng)點(diǎn)閱以下網(wǎng)址:
http://www.shrimpnews.com/FreeRe ... anFreeEMStests.html

cuiluosheng

kanhai 發(fā)表于 2013-12-26 21:07
小崔開(kāi)始走國(guó)際路線了

被逼的啊，沒(méi)有辦法！

syusuke

@Dannyhuang  @拜耳劉濤  @haoye520  @海上積雨云   @蟲(chóng)子的悲哀
好資料  快來(lái)圍觀哦

Dannyhuang

各位好！非常欽佩這些學(xué)者的專業(yè)知識(shí)和責(zé)任感。有幾個(gè)問(wèn)題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原是否已經(jīng)確證為副溶血弧菌？可能稱之為“一株變異副溶血弧菌的檢測(cè)方法”較好。2.好像不是所有患肝胰腺壞死病的對(duì)蝦中都可以分離到副溶血弧菌？3.細(xì)菌PCR鑒定需要套式PCR檢測(cè)嗎？可否更簡(jiǎn)單？4.樣本數(shù)。
以上僅供討論參考。謝謝！

煙花雨

Dannyhuang 發(fā)表于 2013-12-27 13:03
各位好！非常欽佩這些學(xué)者的專業(yè)知識(shí)和責(zé)任感。有幾個(gè)問(wèn)題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原 ...

太高深了，表示看不懂��！

Dannyhuang

接地氣��！

cuiluosheng

Dannyhuang 發(fā)表于 2013-12-27 13:03
各位好！非常欽佩這些學(xué)者的專業(yè)知識(shí)和責(zé)任感。有幾個(gè)問(wèn)題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原 ...

Danny提的問(wèn)題非常好，可以跟臺(tái)灣成功大學(xué)羅竹芳教授發(fā)郵件交流你的想法！

hugo

樓主辛苦了，你們這些資料一般在哪個(gè)網(wǎng)站找到的呢？我以后也好關(guān)注最新信息

hugo

如果跑了電泳之后，還有一個(gè)測(cè)序結(jié)果就更好了，現(xiàn)在還難以確定他們的擴(kuò)增片段就是目標(biāo)片段

cuiluosheng

此為免費(fèi)下載通道！

Dannyhuang

大家比對(duì)一下序列，看看是不是？