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flyjet 2016-7-12 23:40
水產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌的分離檢測(cè) (TCBS 培養(yǎng)基與弧菌顯色培養(yǎng)基） TCBS 培養(yǎng)基分離弧菌 國(guó)標(biāo) GB4789.7-2013 食品微生物學(xué)檢測(cè) 副溶血性弧菌檢測(cè) 中 硫代硫酸鹽 - 檸檬酸鹽 - 膽鹽 - 蔗糖（ TCBS ）瓊脂配方： 酵母膏粉 5g ，蛋白胨 10g ，氯化鈉 10g ，檸檬酸鈉 10g ，硫代硫酸鈉 10g ，膽酸鈉 3g ， 牛膽粉 5g ，蔗糖 20g ，檸檬酸鐵 1g ，瓊脂 15g ，溴麝香草酚蘭 0.04g ，麝香草酚蘭 0.04g 最終 pH 8.6 ± 0.2 TCBS 瓊脂的原理就是發(fā)現(xiàn)蔗糖發(fā)酵產(chǎn)生酸的菌落，霍亂陽(yáng)性，副溶血性弧菌陰性， 副溶血性弧菌 不發(fā)酵蔗糖，菌落呈藍(lán)綠色。 霍亂弧菌 發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸，菌落呈黃色。然后，這些有機(jī)酸，也被這種細(xì)菌利用，分解成二氧化碳揮發(fā)了，有機(jī)酸沒(méi)有了，菌落就重新變成綠色的了。 該培養(yǎng)基中的牛膽粉有抑制其他革蘭氏陽(yáng)性菌的作用，與枸櫞酸鈉和硫代硫酸鈉合用時(shí)，對(duì)大腸桿菌有明顯抑制作用。同時(shí)枸櫞酸鈉和枸櫞酸鐵可使霍亂弧菌免受其他抑菌劑的作用，加之有營(yíng)養(yǎng)豐富的酵母浸粉，霍亂弧菌又能利用蔗糖分解產(chǎn)酸，所以菌落較大，且呈黃色。大腸桿菌等雜菌菌落較小或不生長(zhǎng)，故易識(shí)別。 黃色菌落只要是利用培養(yǎng)基中的蔗糖產(chǎn)酸，菌落就是黃色的，像溶澡弧菌、河流弧菌、麥?zhǔn)匣【⒌纫九囵B(yǎng)基上均為黃色菌落，并不是黃色菌落就是霍亂弧菌。樣品中常常存在大量可以發(fā)酵蔗糖的干擾細(xì)菌，常常會(huì)碰到整個(gè)平板會(huì)變黃色的現(xiàn)象。 另：霍亂弧菌一旦檢出要立即送有關(guān)部門(mén)，普通實(shí)驗(yàn)室是不準(zhǔn)保存的�。� 黑色：細(xì)菌分解含硫物質(zhì)產(chǎn)生硫化氫同時(shí)與培養(yǎng)基中的含鐵物質(zhì)反應(yīng) , 從而產(chǎn)生黑色的菌落 . 以上內(nèi)容來(lái)源于食品伙伴網(wǎng) 選用 TCBS 作為分離培養(yǎng)各種弧菌的培養(yǎng)基，其特異性不是很強(qiáng)；不少細(xì)菌在 TCBS 上也能生長(zhǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)較慢，需培養(yǎng) 24h 后方可長(zhǎng)成 0.5~1mm 的黃，綠色菌落。為有效排除干擾，及時(shí)準(zhǔn)確地判別出是否存在弧菌屬細(xì)菌，可結(jié)合弧菌屬細(xì)菌在 TCBS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的特點(diǎn)：弧菌生長(zhǎng)快，菌落大，培養(yǎng) 4~5h 原劃線(xiàn)處有菌苔生長(zhǎng)， 8~10h 可長(zhǎng)出小菌落， 16h 菌落可達(dá) 2mm; 其他細(xì)菌在 TCBS 上無(wú)此特點(diǎn)。因此，在篩選弧菌屬細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基時(shí)要特別注意在確定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行菌落的觀察，時(shí)間超過(guò)即影響其準(zhǔn)確性。 以上表 2 及文字節(jié)選自浙江工商大學(xué)趙廣英等人論文《水產(chǎn)品中多種致病性弧菌的分離鑒定》。 弧菌顯色培養(yǎng)基 原理： 目標(biāo)菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)生特異性的酶與酶底物作用，底物經(jīng)酶水解作用釋放顯色基團(tuán)使菌落顯色。霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落呈（淡）藍(lán)綠色， 副溶血性弧菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落呈紫紅色。 使用方法 ： 按說(shuō)明書(shū)使用量（不同廠家重量略有不同）稱(chēng)取培養(yǎng)基于 1L 蒸餾水或去離子水（可根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際需要配比加水）；充分混勻，加熱并不斷攪拌至完全溶解，煮沸約 2min; 滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至 50 攝氏度時(shí)，鋪平板，待培養(yǎng)基完全凝固后使用。使用前儲(chǔ)存于暗處。劃線(xiàn)接種后于 37 ℃ 培養(yǎng) 24 小時(shí)。 保存 ：干粉培養(yǎng)基于 30 ℃以下陰涼干燥處存放，制備好的平板于 2-8 ℃避光，可保存一周。 說(shuō)明： 1 、同類(lèi)產(chǎn)品存在不同配方，或采用不同的顯色劑，因此菌落形成的顏色不同。 2 、副溶血性弧菌在該顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)紫紅色菌落； 注意：本培養(yǎng)基中含有的成分對(duì)人體有毒害作用，使用時(shí)請(qǐng)做好防護(hù)措施，避免與眼睛、皮膚接觸，避免吸入或吞食。 目前有進(jìn)口科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基（干粉），國(guó)產(chǎn)陸橋弧菌顯色培養(yǎng)基（干粉），陸橋有新推出弧菌顯色培養(yǎng)基平板等產(chǎn)品。 按照國(guó)標(biāo)方法配置的 TCBS 培養(yǎng)基價(jià)格比價(jià)便宜�；【@色培養(yǎng)基價(jià)格相對(duì) TCBS 比較貴。一塊弧菌顯色培養(yǎng)基成本大約要十幾塊，對(duì)于蝦農(nóng)來(lái)說(shuō)是一筆不小的開(kāi)支。不過(guò)弧菌顯色培養(yǎng)基對(duì)于副溶血弧菌等目標(biāo)菌的分離效果要好于 TCBS 培養(yǎng)基，開(kāi)發(fā)殺弧菌藥品，噬弧菌等的公司可以用來(lái)驗(yàn)證藥品殺弧菌，特別是殺副溶血性弧菌的驗(yàn)證。市面上水產(chǎn)用的 TCBS 培養(yǎng)基如果按照國(guó)標(biāo) GB4789.7 TCBS 配方生產(chǎn)的產(chǎn)品，也就是常用的黃弧菌，綠弧菌培養(yǎng)基，可能實(shí)際上對(duì)弧菌的分離效果并不明顯，國(guó)標(biāo) 4789.7 是食品行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)，在檢出目標(biāo)菌后一般還有進(jìn)一步生化鑒定，以確定是哪類(lèi)弧菌。但蝦農(nóng)并不具備進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的技術(shù)和能力，只能根據(jù)肉眼判斷黃弧菌或者綠弧菌，而無(wú)法得知是否是導(dǎo)致蝦病的致病弧菌�；【@色培養(yǎng)基可以區(qū)分副溶血弧菌及其他幾種致病菌，對(duì)于殺弧菌產(chǎn)品的藥品公司有一定針對(duì)性，至少可以驗(yàn)證殺弧菌前后幾類(lèi)致病弧菌的數(shù)量驗(yàn)證殺弧菌效果。
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